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      常用緩沖劑的配制

      發布時間:2015-8-10 訪問人數: 4137
      Tris緩沖液
      生物學反應僅在氫離子很窄的濃度范圍內充分進行。但是,自相矛盾的是許多這樣的反應自身在產生或消耗質子。緩沖液是一類在特定的pH范圍內耐受可逆質子化作用的物質,因此它在容許的極限內可維持氫離子濃度。完善的緩沖液像圣杯一樣,總是可望而不可即的。理想的生物學緩沖液應是:
      ·pKa在pH 6.0和pH 8.0之間
      ·對多種化學試劑和酶是惰性的
      ·高度極性,也就是說在水溶液中能完全溶解而又未必會擴散進生物膜,從而影響胞內pH
      ·非毒性的
      ·廉價
      ·不易受鹽和溫度效應的影響
      ·不吸收可見光或紫外光
      在分子生物學中所用的緩沖液沒有一種完全達到這些標準。已知數量有限的弱酸具有10-7~10-9之間的解離常數。在無機鹽中,僅有硼酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽和銨鹽處于這種范圍之內。但是,它們在某種程度上與生理介質是不相容的。
      在1946年,G.Gomori提出,有機多胺可用來將pH控制在6.5~9.7之間的范圍內。他研究的三種化合物中的一種是Tris(2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇),其實早在1897年,Piloty和Ruff已,經首次描述過。對于許多生物化學目的而言,Tris成為了非常滿意的緩沖液,迄今Tris仍是用于分子克隆中大多數酶反應的標準緩沖液。
      表A1-1 各種pH值的Tris緩沖液的配制
      所需pH值(25oC) 所需0.1mol/L HCI的體積/mL

      7.10
      45.7
      7.20
      44.7
      7.30
      43.4
      7.40
      42.0
      7.50
      40.3
      7.60
      38.5
      7.70
      36.6
      7.80
      34.5
      7.90
      32.0
      8.00
      29.2
      8.10
      26.2
      8.20
      22.9
      8.30
      19.9
      8.40
      17.2
      8.50
      14.7
      8.60
      12.4
      8.70
      10.3
      8.80
      8.5
      8.90
      7.0

      某一特定pH0.05mol/LTris緩沖液的配制:將50mL 0.1 mol/L Tris堿溶液與上表所示相應體積(mL)0.1mol/L HCl混合,加水將體積調至100ml。
      Tris緩沖液
      Tris初次引起廣泛注意的商業的成功之一是在魚的運輸時降低了魚的死亡率。在20世紀40年代,活魚是在盛有海水的桶里運往市場的。不幸的是,許多魚因C02的積聚使pH下降而致死。為了解決這個問題,在水中加入麻醉劑以便使魚的代謝活動降至最低限度,即使這樣也只能部分地得到緩解。這些麻醉劑對那些吃了這種魚的人到底有什么作用沒有記載。1958年,McFarland和Norris在海水中加入Tris穩定其pH,的確降低了魚的死亡率并使食魚者愈加愛吃。Tris也成了用于許多生化目的非常滿意的緩沖液,也是目前用于分子克隆中大多數酶反應的標準緩沖液。
      Tris(羥基甲基氨基甲烷)有很高的緩沖能力,在水中高度溶解,對很多種酶反應是惰性的。但是,Tris也有許多不足之處:
      .Tris的pKa值是pH 8.0(20oC),這就意味著在pH值小于7.5和大于9.0時,Tris的緩沖能力是非常低的。
      .溫度對Tris的解離有顯著影響。溫度每升高loC,Tris溶液的pH值則降低約0.03 pH單位。例如,0.05mol/L Tris在5oC,25 oC ,37 oC 時,其pH值分別為9.5,8.9和8.6?茖W文獻中Tris溶液的pH指的是在25 oC 測定的pH。配制Tris的貯存液時,最好是將pH調到所希望的范圍,然后使之冷卻至25 oC 再進行最終校正。
      .Tris與許多類型含有亞麻纖維接頭的pH電極起反應,顯然Tris能與亞麻纖維起反應。這種影響表現在電動勢(emf)漂移,平衡時間加長。因此,具有亞麻纖維接頭的電極不能精確測定Tris溶液的pH值。只能使用具有陶瓷或玻璃接頭的電極測定Tris溶液的pH值。
      .濃度對Tris解離有顯著影響。例如,10 mmol/L和100 mmol/L Tris溶液的pH值會相差0.1pH單位,溶液的濃度越大則其pH值越高。
      .Tris對許多哺乳動物有毒性。
      .Tris作為伯胺,不能用于像戊二醛和甲醛這樣的固定劑。Tris也與乙二醛反應。通常用磷酸鹽或MOPS緩沖液替代Tris,用于這些試劑。
      TRIS是一種在pH 7.5以下緩沖能力很差的緩沖液。在20世紀60年代中期,為了獲得在pH 7.5以下具有更好緩沖能力的緩沖液,N.Good和他的同事研制一系列N-取代的氨基磺酸作為生物學上相關pH值的強兩性離子。如果沒有這些緩沖液,對于分子克隆極為重要的一系列技術要么全然不會存在,要么大大降低工作效率。這些技術包括:哺乳細胞的高效轉染(HEPES,TricineBES),RNA的凝膠電泳(MOPS)和細菌的高效轉化(MES)。

      縮寫詞
      化學名稱
      FW
      pKa
      使用pH值范圍
      MES
      2—(N—嗎啉代)乙磺酸
      195.2
      6.1
      5.5—6.7
      Bis-Tris
      二(2—羥乙基)亞氨基Tris(羥甲基)甲烷
      109.2
      6.5
      5.8—7.2
      ADA
      N(2—乙酰氨基)—2—亞氨基雙乙酸
      190.2
      6.6
      6.0~7.2
      ACES
      2[(2—氨基—2氧代乙基)氨基]乙磺酸
      182.2
      6.8
      6.1~7.5
      PIPES
      哌嚓—N,N—hs二(2—乙磺酸)
      302.4
      6.8
      6.1~7.5
      MOPSO
      3—(N—嗎啉代)—2—羥基丙磺酸
      225.3
      6.9
      6.2~7.6
      Bis-TrisPropane
      1,3—二[tns(羥甲基)甲基氨基]丙烷
      282.3
      6.8
      6.3--9.5
      BES
      N,N—二(2—羥乙基)—2—氨基乙磺酸
      213.2
      7.1
      6.4—7.8
      MOPS
      3—(N—嗎啉代)丙磺酸
      209.3
      7.2
      6.5~7.9
      HEPES
      N—(2—羥乙基)哌嚓—N/—(2—乙磺酸)
      238.3
      7.5
      6.8~8.2
      TES
      N-tris(羥甲基)甲基—2—氨基乙磺酸
      229.2
      7.4
      6.8—8.2
      DIPSO
      3—[N,N—二(羥乙基)氨基]—2—羥基丙磺酸
      243.3
      7.6
      7.0—8.2
      TAPSO
      3—[N—tris(羥甲基)甲基氨基]—2—羥基丙磺酸
      259.3
      7.6
      7.0—8.2
      TRIZAMA
      ths(羥甲基)氨基甲烷
      121.1
      8.1
      7.0-9.1
      HEPPSO
      N—(2—羥乙基)哌嗪—N/—(2—羥基丙磺酸)
      268.3
      7.8
      7.1~8.5
      POPSO
      哌嚓—N,N/—二(2—羥基丙磺酸)
      362.4
      7.8
      7.2--8.5
      EPPS
      N—(2—羥乙基)哌嚓—N/—(3—丙磺酸)
      252.3
      8.0
      7.3~8.7
      TEA
      三乙醇胺
      149.2
      7.8
      7.4~8.3
      Tricine
      N—tr詛(羥甲基)甲基甘氨酸
      179.2
      8.1
      7.4--8.8
      Bicine
      N,N—二(2—羥乙基)甘氨酸
      163.2
      8.3
      7.6—9.0
      TAPS
      N—tris(羥甲基)甲基—3—氨基丙磺酸
      243.3
      8.4
      7.7--9.1
      AMPSO
      3—[(1,1—二甲基—2—羥乙基)氨基]—2—羥基丙磺酸
      227.3
      9.0
      8.3—9.7
      CHES
      2—(N—環己基氨基)乙磺酸
      207.3
      9.3
      8.6—10.0
      CAPSO
      3—(環己基氨基)—2—羥基—1—丙磺酸
      237.3
      9.6
      8.9—10.3
      AMP
      2—氨基—2—甲基—1—丙醇
      89.1
      9.7
      9.0~10.5
      CAPS
      3—(環己基氨基)—1—丙磺酸
      221.3
      10.4
      9.7—11.1

      磷酸緩沖液(Gomori緩沖液)
      最通用的磷酸鹽緩沖液是以其發明者Gomori命名的。該緩沖液是由單價磷酸二氫鹽和雙價磷酸一氫鹽的混合物組成的。通過變化每種鹽的量,就可配制出pH 5.8至pH8.0之間緩沖液(見表A1-3A和A1-3B)。磷酸鹽有很高的緩沖能力,在水中高度可溶。但是,它們也有不少潛在的缺點:
      ·磷酸鹽緩沖液抑制許多酶促反應和步驟,而這些酶促反應和步驟恰恰是分子克隆的基礎,其中包括許多限制酶對DNA的切割,DNA的連接和細菌轉化等。
      ·因為磷酸鹽在乙醇中沉淀,不能用于沉淀DNA和RNA。
      ·磷酸鹽螯合像Ca2+和Mg2+這樣的陽離子。
      表A1-3A 25℃下0.1mol/L磷酸鉀緩沖液的配制

      pH
      1 mol/L K2HP04的體積/mL
      1 mol/L KH2PO4的體積/mL
      5.8
      8.5
      91.5
      6.0
      13.2
      86.8
      6.2
      19.2
      80.8
      6.4
      27.8
      72.2
      6.6
      38.1
      61.9
      6.8
      49.7
      50.3
      7.0
      61.5
      38.5
      7.2
      71.7
      28.3
      7.4
      80.2
      19.8
      7.6
      86.6
      13.4
      7.8
      90.8
      9.2
      8.0
      94.0
      6.0

      注:根據Green(1933)的資料匯編。
      用蒸餾水將混合的兩種1mol/L的貯存液稀釋至1000mL。根據Henderson-Hasselbaleh方程計算其pH值:
      pH=pK"+Log,在此,pK"=6.86(25℃)
      表A1-3B 25℃下0.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制

      pH
      1mol/L Na2HPO4的體積/mL
      1mol/L NaH2P04體積/mL
      5.8
      7.9
      92.1
      6.0
      12.0
      88.0
      6.2
      17.8
      82.2
      6.4
      25.5
      74.5
      6.6
      35.2
      64.8
      6.8
      46.3
      53.7
      7.0
      57.7
      42.3
      7.2
      68.4
      31.6
      7.4
      77.4
      22.6
      7.6
      84.5
      15.5
      7.8
      89.6
      10.4
      8.0
      93.2
      6.8

      用蒸餾水將混合的兩種1mol/L貯存液稀釋至1000mL。根據Henderson-Hassdbalch方程計算其pH值:
      pH=pK"+Log,在此,pK"=6.86(25℃)

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